Las pitones, igual que sus parientes cercanas las boas, son serpientes constrictoras, y por definición, no venenosas. Normalmente atacan, emboscadas, a animales que pasan cerca. Matan a sus presas por asfixia, agarrándola primero con la boca y enrollando rápidamente su cuerpo alrededor de ellas. Una vez así, se ejercen presiones altas sobre las costillas y pulmones de su presa, que de este modo no pueden inhalar. A pesar de que la presa puede sufrir también problemas de circulación, especialmente si la serpiente presiona mucho alrededor de su cuello, la muerte por asfixia se produce habitualmente mucho antes. En contra de la creencia popular, estas serpientes tampoco estrujan o aplastan a sus presas, y cuando matan a una de tamaño normal, en la gran mayoría de los casos la presión que ejerce la serpiente no es suficiente para romper ningún hueso.
Gran parte de las pitones se alimentan de animales de "sangre caliente", como pájaros y mamíferos, aunque se sabe de especies que capturan también otros reptiles (incluyendo otras serpientes), anfibios y peces. El tamaño de las presas varía enormemente, pero suelen ser de pequeño tamaño (las especies grandes consumen animales del tamaño de un gato doméstico). Las presas grandes están también a su alcance; algunas especies asiáticas de gran tamaño pueden matar cérvidos adultos, y se ha señalado que la pitón de Seba (Python sebae) se alimenta ocasionalmente de gacelas. Las pitones, como el resto de las serpientes, engullen completamente a sus presas y la digestión dura varios días. Si la presa es de gran tamaño, puede requerir incluso varias semanas.
A pesar del tamaño de algunas especies, el ser humano se encuentra fuera del tamaño habitual de sus presas, por lo que generalmente son inofensivas, excepto si se las asusta o provoca. Las hembras pueden comportarse de forma más agresiva si están protegiendo los huevos. Por el contrario y de forma desproporcionada en relación al peligro que suponían, el hombre ha cazado incesantemente a las pitones hasta llevar a algunas especies, como la pitón india (Python molurus) al borde de la extinción.
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